重組DNA技術(選修)

 重組DNA技術

 

前題知識:

1. 重組DNA技術是甚麼?

 

基本原理: (留意跟必修部份的寫法差異，更具體而已。)

1. 使用限制性(核酸)內切酶獲取含有目標基因的DNA片段。

2. 使用以上相同的內切酶切開載體的DNA。

3. 使用DNA連接酶把含目標基因的DNA片段與載體結合，形成已重組的載體。

4. 把已重組的載體放入宿主細胞內(稱為轉化)，讓宿主細胞表達已重組載體上攜帶的目標基因。

備註: 最常用的載體是細菌的質粒(有些書寫質體)。

 

選修部分的要求，需要完全理解以上的原理，從而可判斷如何實際操作。

 

因此，需要好好掌握以下的問題: (建議答案在最後)

1. 限制性核酸內切酶其實是根據甚麼準則把DNA切成不同片段的?

2. 使用限制內切酶，跟使用其他方法(例如加熱)，一樣可以把DNA片段切開，取得含有目標基因的DNA片段。那使用限制內切酶有甚麼優點?

3. 使用限制內切酶一般情況下仍無法確保祇截取到目標基因。為甚麼?

4. 使用限制內切酶一般情況下仍無法確保祇截取到目標基因。這狀況又可能會出現甚麼問題?

5. 為何要使用載體(例如質粒)攜帶目標基因的DNA片段，而不把目標基因直接放入宿主細胞內?

6. 其中一種常用的載體是質粒。質粒是甚麼?

7. 使用細菌的質粒作為載體，有甚麼優點?(提示: 如用相同的限制酶切割細菌本身的DNA的話，估計會有甚麼情況發生?)

8. 把理論上已重組的載體放入宿主細胞後，實際上會出現三類細胞? 試估計是哪三類? (提示: 以上原理涉及的過程，其實不一定全部成功的。)

9. 宿主細胞不一定是細菌的，視乎重組DNA的目的甚麼。 但要制造人類胰島素，使用細菌作為宿主便很適合，為甚麼?

10. 如何篩選出具有已重組載體的細菌? 原理是甚麼?

 

 

建議答案:

1. 限制性核酸內切酶其實是根據甚麼準則把DNA切成不同片段的?

          答: 根據鹼基序列。不同的內切酶會識別不同長度的鹼基序列，然後從中切開，形成黏端或鈍端。

2. 使用限制內切酶，跟使用其他方法(例如加熱)，一樣可以把DNA片段切開，取得含有目標基因的DNA片段。那使用限制內切酶有甚麼優點?

          答: 使用內切酶可識別特定的鹼基序列，從而可從目標基本的DNA及質粒皆可切出相同鹼基序列的黏端，更容易把目標基因與質粒結合。

                   但加熱的話，每次DNA片段及質粒斷開的位置皆不同，無法有效把目標基因與基粒結合。

3. 使用限制內切酶一般情況下仍無法確保祇截取到目標基因。為甚麼?

          答: 因為限制內切酶的識別鹼基序列位置並不一定是目標基因的起始及結束位置。

4. 使用限制內切酶一般情況下仍無法確保祇截取到目標基因。這狀況又可能會出現甚麼問題?

          答: 因為限制內切酶可能截取了多餘的DNA片段，而這些多餘的DNA片段內含有甚麼基因也未必清楚，因此會帶來一些不可預期的後果。

5. 為何要使用載體(例如質粒)攜帶目標基因的DNA片段，而不把目標基因直接放入宿主細胞內?

          答: 直接插入宿主細胞內的話，要宿主細胞表達目標基因，目標基因便要先插入宿主細胞的DNA內，這可能做成宿主細胞自身的DNA破壞。另外，外來的目標基因，宿主細胞的免疫系統也可能作出反應，破壞外來的物質。

                   而載體是已知宿主會接受的物質，因此成功概率更高。

6. 其中一種常用的載體是質粒。質粒是甚麼?

          答: 質粒是細菌內一些細小的環狀DNA，一般來說不會影響細菌的活動。

7. 使用細菌的質粒作為載體，有甚麼優點?(提示: 如用相同的限制酶切割細菌本身的DNA的話，估計會有甚麼情況發生?)

          答: 質粒細小，呈環狀，使用內切酶的話，便較大概率祇切出一個開口，而不是許多小段，較易形成重組質粒。

8. 把理論上已重組的載體放入宿主細胞後，實際上會出現三類細胞? 試估計是哪三類? (提示: 以上原理涉及的過程，其實不一定全部成功的。)

          答: (1) 含有已重組質粒的。

             (2) 含有沒有重組質粒的。

             (3) 沒有質粒的。

9. 宿主細胞不一定是細菌的，視乎重組DNA的目的甚麼。 但要制造人類胰島素，使用細菌作為宿主便很適合，為甚麼?

          答: 如要大量制造胰島素的話，細菌可接受質粒，較易把已重組，含有人類胰島素基因的載入細菌內。而且，細菌可表達已重組質粒的人類胰島素基因，可產生人類胰島素。

                   細菌的繁殖速率也很快，可短時間大量繁殖。

10. 如何篩選出具有已重組載體的細菌? 原理是甚麼?

          答: 其他要視乎重組的基因是甚麼。一般來說，使用一些識別工具便可以。

          例如，

(1) 選擇一些同時攜帶2款抗生素(例如A及B)抗性基因的質粒。

          (2) 使用一種會同時切斷其中一款(例如A)抗生素抗性基因的限制內切酶。

          (3) 重組後，應出現以下三類宿主細胞:

                  

	抗生素A抗性	抗生素B抗性
(a) 已重組質粒	沒有(因被限制酶切斷)	有
(b) 沒有重組質粒	有	有
(c) 沒有質粒	沒有	沒有

          (4) 使用抗生素B培養宿主細菌，(c)應死掉，祇餘(a)及(b)。

          (5) 然後再使用抗生素A培養(a)及(b)，(a)會死掉。因此從這步驟便可篩選出(a)。